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　　非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒感染豬引起的一種急性、高致死性傳染病。該病自2018年傳入我國，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于病毒感染和致病機(jī)制不清楚，而且缺乏商品化的疫苗和特效藥物，非洲豬瘟的防控形勢仍然異常嚴(yán)峻。因此，解析非洲豬瘟病毒感染和致病機(jī)制是當(dāng)前迫切需要研究的科學(xué)問題。在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程、國家自然科學(xué)基金委非洲豬瘟重點(diǎn)專項(xiàng)和獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室課題的資助下，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所青年科研人員，克服重重困難，在非洲豬瘟基礎(chǔ)研究上取得一系列重要研究進(jìn)展，為新型非洲豬瘟病毒減毒疫苗的研發(fā)提供了重要科學(xué)依據(jù)。

1. 揭示了非洲豬瘟病毒MGF505-7R基因與病毒致病力相關(guān) 

　　發(fā)現(xiàn)和鑒定非洲豬瘟關(guān)鍵毒力基因是非洲豬瘟減毒活疫苗研發(fā)的基礎(chǔ)。2021年7月26日，哈爾濱獸醫(yī)研究所發(fā)現(xiàn)了一個(gè)非洲豬瘟病毒關(guān)鍵毒力基因，并在致病機(jī)制研究上取得新進(jìn)展，相關(guān)研究結(jié)果以 “pMGF505-7R determines pathogenicity of African swine fever virus infection by inhibiting IL-1βand type I IFN production”為題，發(fā)表在《PLoS Pathogens》雜志上。該研究證實(shí)非洲豬瘟多基因家族蛋白pMGF505-7R與非洲豬瘟病毒的致病力密切相關(guān)。

　　研究發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞能抑制多種刺激誘導(dǎo)的IL-1β和IFN-β的升高，提示非洲豬瘟病毒編碼蛋白可能抑制IL-1β和IFN-β產(chǎn)生。通過篩選，研究人員發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒多基因家族（MGF）505/360多數(shù)成員對IL-1β和IFN-β產(chǎn)生具有抑制作用，其中pMGF505-7R的抑制作用最為顯著。敲除MGF505-7R基因的重組病毒能夠誘導(dǎo)更高水平的IL-1β和IFN-β的產(chǎn)生，表明pMGF505-7R對IL-1β和I型干擾素產(chǎn)生具有抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)pMGF505-7R通過與IKK復(fù)合物相互作用抑制IL-β基因的轉(zhuǎn)錄，并且其靶向NLRP3炎癥復(fù)合體抑制IL-β的分泌。而在I型IFN信號通路中，pMGF505-7R靶向IRF3抑制I型IFN的產(chǎn)生。動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，缺失MGF505-7R基因的重組非洲豬瘟病毒對仔豬的致病力降低，感染豬血清中IL-1β和IFN-β的蛋白水平升高，而組織器官病毒載量顯著降低。這些研究成果初步揭示了非洲豬瘟病毒的免疫逃逸的一種新策略，為非洲豬瘟病毒致病機(jī)制探索和疫苗的研發(fā)提供了新的理論依據(jù)。

2. 揭示了非洲豬瘟病毒免疫逃逸新的機(jī)制

　　非洲豬瘟病毒免疫逃逸機(jī)制與病毒的致病力和抗病毒豬的遺傳育種密切相關(guān)。2021年11月10日，哈爾濱獸醫(yī)研究所在非洲豬瘟病毒免疫逃逸機(jī)制研究上取得新進(jìn)展，研究成果以 “African swine fever virus pI215L negatively regulates cGAS-STING signaling pathway through recruiting RNF138 to inhibit K63-linked ubiquitination of TBK1”為題，發(fā)表在《Journal of Immunology》雜志上，并被主編推薦為Top Read文章。該研究發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒編碼的pI215L蛋白能夠抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，并闡明了該蛋白抑制Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制。

　　先天免疫是宿主抵抗病原微生物感染的第一道防線，炎癥反應(yīng)和I型干擾素是先天免疫應(yīng)答的重要成分，非洲豬瘟病毒感染如何逃逸宿主的先天免疫系統(tǒng)的監(jiān)視，其與病毒致病力的關(guān)系尚不完全清楚。已有研究表明，ASFV拮抗干擾素（IFN）產(chǎn)生的基因與其致病力密切相關(guān)，缺失ASFV拮抗IFN產(chǎn)生的基因是研發(fā)ASFV疫苗的有效策略之一。

　　利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選了ASFV 編碼的102個(gè)蛋白對干擾素啟動子活性的影響，科研人員發(fā)現(xiàn)ASFV編碼的E2泛素結(jié)合酶（pI215L）對干擾素產(chǎn)生的抑制作用最為顯著。利用siRNA敲低pI215L的表達(dá)顯著抑制了ASFV的復(fù)制，但增強(qiáng)了ASFV誘導(dǎo)的IFN-β和ISG56的產(chǎn)生。利用免疫共沉淀聯(lián)合質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)與pI215L相互作用的E3泛素連接酶RNF138。pI215L通過招募RNF138并促進(jìn)RNF138降解RNF128，進(jìn)而抑制RNF128對TBK1的K63位泛素化修飾，最終抑制IFN-β產(chǎn)生。這些研究成果闡明了ASFV免疫逃逸的一種新機(jī)制，將為ASFV減毒疫苗的研制提供線索。

3. 發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒新的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)基因

　　細(xì)胞凋亡在病毒感染、復(fù)制和致病機(jī)制中起著非常重要的作用。2021年11月9日，哈爾濱獸醫(yī)研究所發(fā)現(xiàn)一個(gè)非洲豬瘟病毒基因的新功能，并在其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制上取得新進(jìn)展?？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)并證實(shí)非洲豬瘟病毒的pE199L基因是一個(gè)新的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，能夠誘導(dǎo)線粒體依賴性的細(xì)胞凋亡，相關(guān)研究結(jié)果以“African swine fever virus pE199L induces mitochondrial-dependent apoptosis”為題，發(fā)表在《Viruses》雜志上。

　　ASFV感染豬后，臨床特征表現(xiàn)為感染的組織內(nèi)大量細(xì)胞死亡以及淋巴細(xì)胞枯竭，然而該病毒感染引起細(xì)胞死亡的分子機(jī)制目前仍不清楚。研究人員從ASFV編碼的94個(gè)蛋白中篩選并鑒定出4個(gè)病毒蛋白能夠引起細(xì)胞死，其中pE199L的作用最為顯著。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在豬源細(xì)胞（CRL-2843）和人源細(xì)胞（HEK293T和HeLa）中，異源表達(dá)的pE199L可顯著誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并且表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞凋亡特征，包括核皺縮、核DNA片段化、凋亡小體形成等。而在ASFV感染過程中，下調(diào)pE199L的表達(dá)可明顯降低細(xì)胞的死亡。另外，pE199L的表達(dá)導(dǎo)致線粒體膜電位勢能下降，細(xì)胞色素C釋放以及凋亡相關(guān)激酶caspase-9和-3/7的激活，說明pE199L通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。

　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，pE199L能夠與BCL-2凋亡家族的抗凋亡成員（如BCL-XL、MCL-1、BCL-W、BCL-2A1）相互作用，并且與BAK競爭結(jié)合BCL-XL，從而促進(jìn)BAK和BAX的活化，最終引起線粒體依賴性細(xì)胞凋亡。本研究為進(jìn)一步了解非洲豬瘟病毒的致病機(jī)制提供了新的線索。

4. 發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟病毒pS273R蛋白抑制細(xì)胞焦亡的機(jī)制

　　病毒感染誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及其負(fù)調(diào)控機(jī)制一直是免疫學(xué)研究的前沿和重點(diǎn)。2021年11月15日，哈爾濱獸醫(yī)研究所在非洲豬瘟病毒感染誘導(dǎo)炎癥的負(fù)反饋機(jī)制研究上再次取得新進(jìn)展?？蒲腥藛T發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒pS273R能夠通過非典型切割Gasdermin D從而抑制細(xì)胞焦亡，相關(guān)研究結(jié)果以“African Swine Fever Virus pS273R Inhibits Pyroptosis by Non-canonically Cleaving Gasdermin D”為題，將發(fā)表在《Journal of Biological Chemistry》雜志上。

　　非洲豬瘟病毒基因組是一個(gè)長鏈雙鏈DNA，編碼超過150種蛋白質(zhì)，其中一些蛋白質(zhì)不僅參與病毒的生命周期，還參與病毒的免疫逃逸，但大部分蛋白的功能未知。初步研究發(fā)現(xiàn)ASFV編碼的一種半胱氨酸蛋白酶pS273R能夠結(jié)合細(xì)胞焦亡的執(zhí)行蛋白Gasdermin D (GSDMD)。進(jìn)一步的研究表明，非洲豬瘟病毒 pS273R依賴其酶活性特異性切割GSDMD的G107-A108位點(diǎn)，產(chǎn)生一個(gè)較短的GSDMD 氨基端片段（GSDMD-N1-107）。有趣的是，該片段與宿主細(xì)胞Caspase-1切割GSDMD產(chǎn)生的氨基端片段（GSDMD-N1-279）不同，GSDMD-N1-107不觸發(fā)細(xì)胞焦亡或抑制非洲豬瘟病毒復(fù)制。進(jìn)一步的鑒定結(jié)果顯示 pS273R能夠通過切割GSDMD阻礙細(xì)胞焦亡的發(fā)生，從而有利于病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)完成復(fù)制周期。這些研究成果揭示了一種未被認(rèn)識到的非洲豬瘟病毒抑制細(xì)胞焦亡的機(jī)制，這突顯了pS273R在炎癥反應(yīng)和非洲豬瘟病毒復(fù)制中的重要功能。

5. 發(fā)現(xiàn)影響非洲豬瘟病毒粒子形態(tài)的功能基因

　　非洲豬瘟病毒感染性顆粒的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，但是大多數(shù)病毒結(jié)構(gòu)蛋白的定位及功能仍有待闡明。2021年11月17日，哈爾濱獸醫(yī)研究所在非洲豬瘟病毒編碼蛋白功能研究上取得新進(jìn)展，科研人員首次發(fā)現(xiàn)非洲豬瘟病毒pH240R能夠影響病毒粒子的組裝從而降低子代病毒粒子的感染性，相關(guān)研究成果以“Deletion of the H240R Gene of African Swine Fever Virus Decreases Infectious Progeny Virus Production Due to Aberrant Virion Morphogenesis and Enhances the Inflammatory Cytokine Expression in Porcine Macrophages”為題，發(fā)表在《Journal of Virology》雜志上。

　　免疫電鏡結(jié)果顯示病毒的結(jié)構(gòu)蛋白pH240R為衣殼蛋白，通過蛋白相互作用試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pH240R與主要衣殼蛋白p72存在相互作用。

　　進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與ASFV HLJ/18毒株相比，ASFV-ΔH240R傳染性子代病毒滴度降低了約100倍，而病毒基因組拷貝數(shù)沒有明顯變化，表明產(chǎn)生了大量無感染性的子代病毒。通過透射電鏡觀察，科研人員在ASFV-ΔH240R感染的原代豬肺泡巨噬細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了含有管狀結(jié)構(gòu)和雙葉狀結(jié)構(gòu)的病毒粒子，占所有病毒粒子的近98%。pH240R不影響病毒細(xì)胞結(jié)合、內(nèi)吞或排出，而是影響ASFV的組裝。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，與ASFV HLJ/18毒株相比，ASFV-ΔH240R感染原代豬肺泡巨噬細(xì)胞后，誘導(dǎo)了更高水平的炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β等的表達(dá)，提示H240R可能抑制了病毒感染誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。該研究首次鑒定了一個(gè)新的衣殼蛋白，并為揭示非洲豬瘟感染機(jī)制提供了全新視角。