近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室王曉鈞團隊首次揭示了豬作為流感病毒“混合器”的分子機制，證明了宿主蛋白ANP32A是豬支持禽流感病毒復(fù)制所必需的宿主因子，并明確了其與禽源聚合酶相互作用的關(guān)鍵位點。相關(guān)研究成果以“A unique feature of swine ANP32A provides susceptibility to avian influenza virus infection in pigs”為題于2020年2月21日發(fā)表于國際病原學(xué)專業(yè)學(xué)術(shù)期刊PLoS Pathogens。
A 型流感病毒是引起人和動物流感的主要病原，對人類的生命健康和社會生活形成巨大威脅。豬一直被認(rèn)為是人、禽、豬流感的“混合器”，是促進禽流感與其它物種流感發(fā)生基因重排進而引起流感大流行的重要中間宿主。已知的1918、1957、1968和2009年4次全球性流感大流行都與禽源和其它物種流感病毒的基因重組密切相關(guān)。由于宿主種屬屏障作用，禽流感病毒很難直接傳播到人，但其可輕易傳播到豬。禽流感病毒跨種間傳播需要突破兩個屏障，即血凝素（HA）結(jié)合受體類型和病毒RNA聚合酶的適應(yīng)。豬的細(xì)胞表面已被證實兼具有人、禽流感病毒結(jié)合的受體，這確立了流感病毒感染的第一步。但關(guān)于禽流感病毒RNA聚合酶在豬體內(nèi)的適應(yīng)機制目前并不明確。
流感病毒的RNA聚合酶主要負(fù)責(zé)病毒基因組的轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，在病毒的跨物種傳播中發(fā)揮重要作用。禽流感病毒聚合酶的活性在哺乳動物細(xì)胞中一般是受限的，其無法在人及其它哺乳動物細(xì)胞中進行有效復(fù)制，禽流感病毒跨物種傳播到哺乳動物，往往需要在PB2等聚合酶亞基上發(fā)生一些如E627K等的特定位點突變，聚合酶亞基突變后的病毒具有了在哺乳動物細(xì)胞中復(fù)制的能力。然而已有的研究顯示，禽流感病毒可直接在豬源組織或細(xì)胞中發(fā)生有效復(fù)制而不需發(fā)生哺乳動物適應(yīng)性點突變，這提示豬體內(nèi)存在特殊的分子機制來支持禽流感病毒聚合酶的復(fù)制。
王曉鈞團隊前期研究已經(jīng)證明宿主ANP32A&B蛋白是不同物種流感病毒聚合酶發(fā)揮功能的決定性宿主蛋白。在此基礎(chǔ)上，該團隊進一步利用聚合酶雙熒光報告系統(tǒng)，檢測了不同物種ANP32A&B蛋白對人、禽、豬、犬、馬等不同物種流感病毒的支持作用，結(jié)果提示，相較于其他哺乳動物ANP32A或ANP32B蛋白，豬ANP32A（swANP32A）蛋白能夠特異性支持禽源H7N9及H9N2亞型流感病毒聚合酶活性（圖1）。免疫共沉淀結(jié)果提示，與人ANP32A（huANP32A）相比，swANP32A能特異性與禽源聚合酶復(fù)合體結(jié)合，從而支持禽源聚合酶的活性。為進一步確認(rèn)swANP32A的功能，該團隊構(gòu)建了豬源PK15細(xì)胞ANP32A敲除細(xì)胞系（AKO-PK15），聚合酶活性分析及流感病毒感染實驗證明，swANP32A的缺失導(dǎo)致聚合酶活性劑病毒復(fù)制滴度顯著下降，提示ANP32A是豬源PK15細(xì)胞可以特異性支持禽流感病毒復(fù)制的關(guān)鍵因子。
圖1 不同物種ANP32蛋白對不同物種A型流感病毒的支持活性分析
已有的研究報道顯示禽源流感病毒聚合酶活性依賴于禽源ANP32A上所特有的33個氨基酸的插入片段，而序列比對分析顯示swANP32A不具有禽源ANP32A支持禽流感病毒復(fù)制的關(guān)鍵功能域，即在LRRs與LCAR 區(qū)域之間無33個氨基酸插入序列。進一步的氨基酸序列分析提示swANP32A存在一些氨基酸點突變。通過定點突變結(jié)合聚合酶活性分析，明確了swANP32A蛋白的106V/156S位點是其發(fā)揮支持禽源聚活性的關(guān)鍵位點，也是影響其與禽源聚合酶復(fù)合物結(jié)合的關(guān)鍵位點。
該研究首次從宿主因子角度分析豬作為中間宿主支持禽流感病毒的分子機制，闡明了宿主蛋白ANP32A是支持禽流感跨物種傳播到豬的關(guān)鍵因子，并明確了swANP32A蛋白的關(guān)鍵活性位點106V/156S，為新型抗流感藥物和轉(zhuǎn)基因動物的研發(fā)提供有效靶點（圖2）。
王曉鈞團隊成員張海麗博士為文章第一作者，王曉鈞研究員為通訊作者。該研究得到國家自然基金委創(chuàng)新群體項目（31521005）和黑龍江省自然科學(xué)基金（JC2018010）的資助。
原文鏈接：https://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1008330
圖2 豬作為流感病毒中間宿主的分子機制模式圖
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