近期，我所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點實驗室豬免疫抑制病研究創(chuàng)新團隊利用CRISPR系統(tǒng)，在偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）組裝的過程中實現(xiàn)了量子點對病毒核酸的原位標(biāo)記，并系統(tǒng)的分析了PRV在Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中的侵染過程。相關(guān)論文“Single Virus Tracking with Quantum Dots Packaged into Enveloped Viruses Using CRISPR”在線發(fā)表于美國化學(xué)會權(quán)威期刊Nano Letters（影響因子12.279）上。
用量子點標(biāo)記病毒顆粒，通過單病毒示蹤技術(shù)“可視化”研究病毒對宿主細(xì)胞的相互作用，有助于深入研究病毒的侵染機制。對囊膜病毒而言，囊膜蛋白在病毒侵染的初期需要識別宿主細(xì)胞表面特定的受體，在囊膜上修飾量子點很有可能會影響到病毒對宿主細(xì)胞的侵染性。因此，標(biāo)記病毒內(nèi)部核酸可以最大程度的還原病毒與宿主細(xì)胞間的相互作用，還可以對病毒脫去囊膜后的行為進行示蹤，為病毒致病機制的研究提供更為準(zhǔn)確的信息。然而如何對病毒核酸進行標(biāo)記一直是研究的難題。在CRISPR系統(tǒng)中，Cas9蛋白中兩個氨基酸（D10A, H840A）的突變可以使其內(nèi)切酶活性失活（Cell, 2013, 155: 1479-1491），這意味著gRNA結(jié)合靶序列后內(nèi)切酶活性失活的Cas9蛋白（nuclease-deactivated Cas9, dCas9）不會對其進行剪切。
研究人員將生物素化的dCas9、PRV特異性的gRNA和鏈霉親和素修飾的量子點（SA-QDs）轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞，然后再用PRV感染該細(xì)胞。在dCas9和gRNA的幫助下，量子點可以與細(xì)胞內(nèi)的病毒核酸特異性結(jié)合，隨著病毒的組裝，即可將標(biāo)記在核酸上的量子點包載進入病毒中（圖1）。標(biāo)記后的量子點熒光性質(zhì)和病毒活性并未受到顯著影響。
圖1. 基于CRISPR系統(tǒng)的量子點原位標(biāo)記PRV核酸策略示意圖
隨后，研究人員利用單病毒示蹤技術(shù)分別觀察并分析了PRV在Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中入胞、膜融合、胞內(nèi)運輸、基因組入核等動態(tài)過程。在Vero細(xì)胞中，PRV通過膜融合釋放病毒核衣殼進入細(xì)胞，在胞內(nèi)沿著微管運輸，當(dāng)病毒核衣殼運輸至細(xì)胞核孔后，病毒核酸釋放進入細(xì)胞核。在HeLa細(xì)胞中PRV的侵染過程則截然不同，病毒首先沿著肌動蛋白微絲移動到細(xì)胞膜上，然后形成巨胞飲小體內(nèi)吞進入胞內(nèi)，其在胞內(nèi)的運輸依然是依賴于微管；隨后巨胞飲小體將病毒顆粒遞送到溶酶體內(nèi)，PRV核衣殼在溶酶體內(nèi)通過膜融合的形式釋放進入細(xì)胞質(zhì)中，并繼續(xù)運輸?shù)郊?xì)胞核孔處，最后將病毒核酸釋放入核（圖2）。這些研究結(jié)果為深入揭示PRV的致病機制提供新的參考信息。
圖2. PRV在Vero細(xì)胞和HeLa細(xì)胞中侵染過程示意圖
楊勇博博士為論文的第一作者，安同慶研究員和蔡雪輝研究員為共同通訊作者。本研究得到了中國博士后基金（2018M630236），黑龍江省杰出青年基金（JC2017010）和黑龍江省自然科學(xué)基金（C2018069）的支持。
文章鏈接：https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b05103
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